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              一种增强单细胞免疫印迹检测的光敏水凝胶

              发布日期: 2021-01-29
              浏览人气: 322

               单细胞蛋白分析是一条可以更深入的了解免疫应答、信号传导、靶向治疗的途径。微流控芯片和免疫分析的出现为单细胞蛋白质组学的研究提供了新平台。单细胞免疫印迹法(scWB)是一种可对单细胞表面、胞内和核内蛋白质进行多重检测的方法。它结合了基于微芯片的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(SDS-PAGE)和凝胶内蛋白质光捕获及免疫探针方法。然而,由于原位免疫印迹的特殊性,scWB常常无法检测低丰度的蛋白质。凝胶内免疫探测的成功在很大程度上取决于蛋白质的固定化效率。目前,一种典型的光亲和标记二苯甲酮(BP)可以形成光敏性聚丙烯酰胺凝胶,已广泛用于光捕获和凝胶内免疫探测仪中。然而,其光衍生的中间体目标捕获率低,且会导致目标荧光信号模糊等问题。

              为了克服单细胞免疫印迹方法中的信号背景增强这一瓶颈,近,有报道称2-芳基-5-羧基四唑-赖氨酸的类似物是一种良好的光亲和标记材料,可用于蛋白质靶标的原位固定和特异性位点结合。在这些类似物中,(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5甲酰胺(mPyTC)与传统的光活化基团(包括芳基酮,芳基叠氮化物和二叠氮基)相比,在选择性蛋白质靶标标记中显示出更强的特异性。

              受这些工作的启发,作者在此提出了一种合适的聚丙烯酰胺交联四唑基团,作为一种高效率、高选择性的光活性水凝胶用于凝胶内蛋白质的光固定化。

              基本信息

               
               

              题目:A Photoclick Hydrogel for Enhanced Single-Cell Immunoblotting

              期刊:Advanced Functional Materials

              影响因子:16.836

              通讯作者:丁显廷教授,谢海洋助理研究员

               

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              产品名称

              产品货号

              FITC-BSA

              SF063

              FITC-OVA

              SF069

               

              摘 要

               

              单细胞免疫印迹法的研究进展引起了人们的广泛关注,该方法有助于探索从癌症发展到干细胞生物学等影响生物系统的细胞间变异。该文章报道了一种用于单细胞蛋白质组分析的四唑功能化光敏感水凝胶。该凝胶利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳作为分子筛基质用于交联免疫印迹凝胶内的蛋白质。在很短时间(60s)的长波长紫外线照射下,能有效地将电泳分离的蛋白质捕获到凝胶中,用于随后的抗体原位孵育。文章利用该方法研究了不同药物处理的GES-1/MGC803细胞系中糖蛋白细胞间表达的差异性。与单细胞免疫印迹法相比,应用该光敏感凝胶可同时监测约2000个细胞的蛋白质表达水平,这些细微变化用传统技术可能是检测不到的。该凝胶具有良好的电泳分离能力、良好的蛋白质光固定化效率、较低的自发荧光背景,其优良性能使其在毛细管、微流控芯片原位免疫印迹分析中具有广阔的应用前景,为应用单细胞免疫印迹分析技术研究低丰度蛋白的研究人员提供了解决方案。

               

               

              研究内容与结果

              1、MMP凝胶的合成与特征

              文章作者开发了用于SDS-PAGE和凝胶免疫印迹的四唑功能化聚丙烯酰胺(图1)。首先以N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺为原料合成了功能性光捕获产物2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-羧基羧酸。通过EDCl/HOBt催化的酰胺缩合反应得到N-(3-甲基丙烯酰胺丙基)-2-(1-甲基-1H-吡咯-2-基)-2H-四唑-5-羧酰胺(MAP-mPyTC)(图2a)。将合成的MAP-mPyTC与丙烯酰胺和N,N'-亚甲基双丙烯酰胺共聚,形成mPyTC修饰的聚丙烯酰胺(MMP)凝胶。产生的凝胶可以通过光敏感加成反应共价固定电泳分离的蛋白质(图2b)?;谝韵驴悸?,MMP凝胶是理想的光敏感水凝胶:首先,四唑基具有较高的中间亲电性,因此具有高效率光捕获蛋白的特性。第二,光衍生的羧基腈亚胺中间体与近端亲核试剂,导致O-N?;?,从而产生特定的光加合物。后,当亲核试剂不可用时,光衍生的羧基腈亚胺中间体会迅速淬灭,限制自发荧光并降低背景。

               

              图1

              MAP-mPyTC的紫外可见光谱在346nm处呈现一个峰值,是其的紫外激发波长。以此,用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)评估了MMP凝胶固定光诱导蛋白性能。图2c表明MMP在正常的电泳条件下,凝胶在不暴露于紫外线时仍保持稳定性。图2d表明只需要60s的紫外线照射MMP凝胶就能光固定蛋白质。此外,MMP凝胶优于先前报道BPMAC约85%的光捕获效率。

              作者进一步研究了固定光诱导蛋白的分子范围,并通过结合各种分子量(BSA,卵清蛋白[OVA],胰蛋白酶抑制剂[TI]和溶菌酶)的蛋白质靶标而扩大了靶标库。在60s内成功捕获了所有蛋白质靶标,并且在分子量较小的情况下,捕获动力学遵循相同的指数模式(图2e)。在条件下(紫外线激发时间:60s,MAP-mPyTC浓度:0.6mM),作者观察到蛋白质靶标明显固定在MMP凝胶上,效率分别为92.77±1.35%,分别为91.16±3.91%,86.45±2.81%和82.36±4.44%。

               

              图2

              2、MMP凝胶的免疫印迹分离性能验证

              接下来,对MMP凝胶的性能进行了测试。扫描电子显微镜(SEM)图像显示冻干光敏感凝胶中清晰的多孔结构(图3a,左)。用Image J测量孔径,结果表明MMP凝胶的孔径与普通凝胶PA凝胶相似,而BP-PA凝胶的孔径较?。ㄍ?a,右)。然后,基于这一理论作者研究了MMP凝胶的分离性能,结果表明,在电泳过程中总丙烯酰胺浓度的变化(%T,凝胶孔径的调整)要优于筛选蛋白质靶大小。与PA和BP-PA凝胶电泳相似,观察到MMP凝胶电泳具有较好的分离分辨率(图3b)。总的来说,在电泳30s后MMP凝胶显示了五种物种的良好分离。

              凝胶内免疫检测的另一个瓶颈是水凝胶自荧光干扰,这是用于检测灵敏度低的原位免疫印迹方法一个主要的瓶颈。为了检测自体荧光对检测灵敏度的影响,以牛血清白蛋白作为验证靶,用抗牛血清白蛋白一抗和相应的二抗在凝胶中进行检测。从荧光图像中观察到,BP-PA凝胶中的背景荧光信号明显较高(图3d)。而分析物MMP中条带信号较强(图3e),信噪比显著提高(图3f)。此外,选择性更高的官能团显著避免了非特异性的结合。

               

              图3

              3、MMP凝胶scWB的性能测试

              作者采用常规流程(图4a)来确定scWB的稳定性,同时使用MMP凝胶分析了GES-1-GFP/GES-1细胞系和MGC803-GFP/MGC803细胞系的生物样本(图4b,c)。结果显示GES-1-GFP/MGC803-GFP组和阴性对照组与常规免疫荧光成像和流式细胞术的结果相似(图4d),紫外线对光捕获靶抗原无不良影响,与其他mPyTC衍生物介导的蛋白质研究相一致。

              P-糖蛋白(P-gp)是ATP结合转运蛋白超家族的成员外排蛋白,与化疗耐药有关。研究P-gp表达谱的细胞间差异有助于阐明耐药的潜在机制。为进一步验证所制备的MMP凝胶的对目标蛋白的检测能力,利用诱导剂(利福平)或抑制剂(维拉帕米)处理GES-1/MGC803细胞系,通过scWB对P-gp进行检测其在细胞间的差异性。

              Q-P-gp在MGC803肿瘤细胞中的表达高于GES-1正常胃粘膜上皮细胞(图4e)。利福平诱导组和维拉帕米抑制组的P-gp在GES-1细胞中的表达有显著差异。结果表明,MGC803肿瘤细胞比正常GES-1细胞具有更强的耐药性,P-gp在GES-1细胞中的表达更易受到化学物质的影响?;贛MP的scWB显示的组间差异在传统的免疫印迹分析中是观察不到的。值得注意的是,在BP-PA凝胶中,维拉帕米治疗组P-gp蛋白的荧光信号大多被光敏凝胶的背景荧光所掩盖,但在MMP凝胶中却可以清楚地观察到(图4f)。这些结果表明,作者提出的光敏感凝胶在单细胞分辨率下描绘了低丰度蛋白质的表达水平,可以提供以往方法无法获得的细胞间特异性。

               

              图4

               

               

              研究结论与意义

              综上所述,该文章报道了一种mPyTC修饰的光敏感聚丙烯酰胺凝胶,克服了单细胞蛋白免疫印迹分析中背景荧光信号强的这一瓶颈。在单细胞蛋白质组学研究中,该方法无需荧光信号放大,即可定量分析低丰度蛋白质(≈30000个蛋白质分子)。利用光敏感丙烯酰胺凝胶,能够同时监测约2000个单细胞的蛋白表达水平,文章中分析了GES-1/MGC803细胞系P-糖蛋白表达的细胞间差异。本文所提出的光敏感水凝胶的优点包括易于合成、良好的电泳分离能力、较高蛋白质光固定效率、较低自荧光性,因此,可以用作毛细管和微流控原位免疫印迹分析的光活性聚丙烯酰胺凝胶的替代。

               
               

               

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