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              教你成为平淡无奇的WB实验小能手—样本制备篇

              发布日期: 2021-01-29
              浏览人气: 718

               WB实验流程

               

               

               

              样本制备的步骤

               

               

              关于样本采集和保存,蛋白提取的相关

              知识和技巧请查看:

               

              接下来,让小编带您总结关于蛋白定量和蛋白变性相关的知识点:

               

              蛋白定量

              测定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法、Lowry法Bradford法(考染法)

               
               

              1. BCA法的测定原理是蛋白质将铜离子还原成亚铜离子,后者在碱性溶液中与BCA结合生成紫红色结合物,该复合物在562nm处有吸光值且与蛋白质浓度成正相关性,据此可测定蛋白质浓度??悸硭沽晾对谟卫胱刺鲁屎焐?,大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质—色素结合物在595nm波长下有大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。

               
               

               

               
               

              2. Lowry法又称为Folin-酚试剂法,首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物,然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚上级),产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色,这种深蓝色的复合物在745~750nm处有大的吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

               
               

               

               
               

              3. Bradford法又称为考染法。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高,可检测到微量蛋白,操作简便,试剂配制极简单,重复性好,但干扰因素多??悸硎狭晾禛-250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色,当它通过疏水作用与蛋白质结合后,变成蓝色,大吸收波长从465nm转移到595nm处,在一定的范围内,蛋白质含量与595nm的吸光度成正比,测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

               
               

               

              三者之中,Lowry法与BCA同属化学法,Lowry法是药典中使用的蛋白浓度测定方法,但是操作繁琐,实验时间长。BCA法操作简单,时间短,形成的颜色复合物稳定性强,但可能受一些杂质影响。Bradford属于染料结合法,也易受到去垢剂影响。

               

              蛋白变性

              蛋白变性常用方式是高温煮样,煮样条件设置为100℃,根据样品量的多少,设置时间5~15min,煮样时间过长,一些蛋白可能会产生聚集性沉淀。疏水性极强的蛋白质,如含有多个跨膜结构域的蛋白质,在煮沸时可能会发生聚集或寡聚化,因此,其煮样条件为40℃~55℃条件下,温浴10~60min变性。煮样后的样本于-20℃或-80℃保存。

              提取并定量后,并未加Loading Buffer煮样的蛋白样品,保存于-80℃时,防止反复冻融,并尽量于1周内加Loading Buffer煮样处理,不要超过2周。

               

              在此,为了帮您更好地完成实验,我们推荐索莱宝蛋白定量和蛋白变性相关的配套产品。

              产品名称

              产品货号

              Bradford法蛋白浓度测定试剂盒

              PC0010

              BCA蛋白浓度测定试剂盒

              PC0020

              Lowry法蛋白浓度测定试剂盒

              PC0030

              4×蛋白上样缓冲液

              (含DTT)

              P1015

              4×蛋白上样缓冲液

              (含巯基还原剂)

              P1016

              4×非变性蛋白上样缓冲液

              P1017

               

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