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                记住这些知识点,你能也操作FITC荧光标记抗体

                发布日期: 2021-10-19
                浏览人气: 58
                  FITC荧光标记抗体是目前较为常用的标记抗体的方法,FITC一般呈黄色、褐色或褐黄色粉末或结晶,性质稳定在低温中能保存数年。在碱性条件下,FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基共价结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。
                  
                  一个抗体分子上能标记15~20个FITC分子,被标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力,在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光,通过荧光显微镜进行观察或利用流式细胞仪分析,从而对抗原进行定性、定位或定量。下面就跟随小编一起来了解其操作步骤吧!
                  
                  FITC荧光标记抗体的操作步骤:
                  
                  1、用碳酸氢钠缓冲液pH9.8稀释抗体为1-5mg/m1,或抗体对该缓冲液充分透析,以足以使赖氨酸不解离(去其正电荷),但注意保持大部分蛋白质仍未变性;
                  
                  2、将透析袋放入100m1含0.1mg/MIfitc的pH9.8碳酸氢钠缓冲液(新配制)的烧杯中,用铝铂包烧杯以避光,4℃搅拌过夜;
                  
                  3、上述抗体液对PBS在4℃透析以终止反应。其间至少更换PBS液三次,直致480nm的吸收为零;
                  
                  4、加入0.5g/L的叠氮钠。此后,结合物在4℃避光保存,或分装后在-20℃冻存。
                  
                  FITC荧光标记抗体注意事项:
                  
                  1、偶联反应要求在尽可能接近pH9.8的溶液中进行,而且注意在反应过程中要保持此pH水平;
                  
                  2、要确定在偶联反应缓冲液中不含游离氨基(Tris,氨及叠氮钠均可与FITC反应,因此会降低蛋白质与FITC的偶联率);
                  
                  3、FITC与蛋白质的比值(F/P),可通过测定495m与280nm吸光度来鉴定。此比值的范围应为0.3-1.0。
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