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              普仑司特对GPR17抑制可防TNF-α诱导ATDC5细胞II型胶原降解

              发布日期: 2021-01-11
              浏览人气: 557

              骨关节炎(OA)是常见的关节疾病之一,是关节运动过程中慢性疼痛导致残疾的主要原因。然而,骨关节炎的发病机制是复杂的,目前仍知之甚少。因此迫切需要开发治疗骨关节炎安全有效的策略。通常,骨关节炎的特征是软骨退化、软骨细胞凋亡和滑膜慢性炎症。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是重要的促炎细胞因子之一,参与包括骨关节炎在内的各种慢性炎症疾病。TNF-α的过度表达促进炎症,炎症通过诱导基质金属蛋白酶(MMP)的产生,特别是MMP-3和MMP-13的产生,在OA的发生和进展中起着至关重要的作用。

              MMP-3和MMP-13负责II型胶原的降解。MMP还抑制SRY相关高迁移率族蛋白9(SOX-9)的表达,SOX-9是一种广泛公认的参与软骨形成的转录因子。因此,TNF-α是治疗骨关节炎常用的治疗靶点。干扰素调节因子(IRF)-1是骨关节炎中调节MMP转录的另一个关键因子。IRF-1的上调增强了MMP-3和MMP-13的表达,从而促进软骨降解。此外,据报道氧化应激是软骨细胞凋亡的效应物。活性氧的过量产生诱导JAK2/STAT1途径的激活,该途径调节细胞因子、酶和其他与骨关节炎相关因子的表达。

              G蛋白偶联受体17(GPR17)是G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族的一个孤儿受体。研究表明,GPR17在肺纤维化小鼠模型中可以介导促炎细胞因子如TNF-α的表达。这表明GPR17的阻断可能是治疗炎症相关疾病的一种有前途的方法。然而,GPR17在OA中的生理功能还没有研究。有报道称普仑司特对GPR17信号有抑制作用,被认为是一种合成的GPR17抑制剂,这为研究其在不同细胞中的作用提供了有力的工具。本研究的目的是研究普仑司特是否能通过阻断GPR17的激活而对II型胶原的降解起到?;ぷ饔?/strong>。

               

               

              基本信息

              题目:

              Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF-α-induced loss of type II collagen in ATDC5 cells

              期刊:International Immunopharmacology

              影响因子:3.943

              PMID:32805694 

              通讯作者:杨广勇

              作者单位:温州医科大学附属台州医院

              索莱宝合作产品:

              产品名称

              产品货号

              Mouse MMP-13 ELISA KIT

              SEKM-0172

               

              摘 要

               

              骨关节炎(OA)是一种常见的关节疾病,影响着*数百万的老年人。然而,OA的机制是复杂的,人们对其了解甚少。因此,安全有效的治疗策略还有待发展。G蛋白偶联受体17(GPR17)是一种广泛分布于中枢神经系统(CNS)的孤儿受体。GPR17已成为治疗脑部疾病炎症的靶点。在这项研究中,作者证明了GPR17在ATDC5细胞中表达,并且在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)暴露时增加。作者还发现普仑司特拮抗GPR17可以通过下调细胞内活性氧(ROS)水平和增加超氧化物歧化酶(SOD)对TNF-α的活性而显著抑制氧化应激。有趣的是,普仑司特治疗可防止TNF-α诱导的II型胶原减少。此外,siRNA敲除GPR17可改善TNF-α诱导的II型胶原的降低,这表明GPR17在介导II型胶原损伤中具有重要的作用。普仑司特阻断GPR17,可抑制基质金属蛋白酶3(MMP-3)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达,MMP可导致II型胶原的降解。普仑司特还可以抑制JAK2/STAT1/IRF-1信号通路的激活,从而抑制促炎细胞因子和酶的表达。此外,普仑司特挽救了TNF-α诱导的SOX-9表达降低。总之,这些数据表明GPR17可能是治疗OA的潜在靶点。

               
               

              研究内容及结果

               

              1.GPR17在ATDC5细胞中表达

              作者首先评估GPR17是否在ATDC5细胞中表达。为了评价GPR17的表达情况,作者以G422细胞作为阳性对照,因为GPR17在G422细胞中表达较高。图1A的RT-PCR分析结果显示,与G422细胞中的表达水平相比,ATDC5细胞中GPR17在基因水平上有良好的表达。同样,通过Western blot分析,作者证实GPR17在ATDC5细胞中在蛋白水平上高度表达,如图1B所示。

              图1

              2.TNF-α增加ATDC5细胞中GPR17的表达

              接下来,作者测定了TNF-α对ARDC5细胞中GPR17表达的影响。图2A中的结果显示,与基线相比,三种剂量的TNF-α将GPR17的mRNA水平分别增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。图2B显示,经TNF-α处理后,GPR17的蛋白质水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍。总的来说,TNF-α在基因和蛋白质水平上都表现出很强的促进GPR17表达的能力。

              图2

              3.普仑司特可降低TNF-α诱导的ATDC5细胞氧化应激

              普仑司特的分子结构如图3A所示。为了确定普仑司特对TNF-α诱导的氧化应激的影响,作者测定了ROS和SOD的水平。如图3B所示,TNF-α诱导细胞内ROS水平增加了3.3倍,用5μM和10μM普仑司特处理后,细胞内ROS水平仅增加到2.4倍和1.6倍。同时,TNF-α将SOD活性降至15.6U/100mg蛋白质,而基线时为31.1U/100mg蛋白质。然而,5μM普仑司特将SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白质,10μM普仑司特进一步将其提高到29.8U/100mg蛋白质(图3C),接近基线水平。普仑司特表现出剂量依赖性的抗氧化作用。

              图3

              4.普仑司特抑制TNF-α诱导的II型胶原减少

              抑制细胞中II型胶原降解是预防和治疗OA的普遍靶点。这篇研究中,作者试图确定普仑司特对TNF-α诱导的II型胶原减少的影响。Col2a1的mRNA水平在单独暴露于TNF-α时降低到45%,而用5μM和10μM普仑司特处理时,Col2a1的mRNA水平分别上升到68%和92%,结果如图4A所示。图4B显示,与上述相同剂量的普仑司特可使Ⅱ型胶原的蛋白质含量提高到71%和94%,而TNF-α处理组的Ⅱ型胶原的蛋白质含量为51%。

              图4

              5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF-α诱导的II型胶原减少

              普仑司特作为GPR17的公认拮抗剂,其对ATDC5细胞的?;ぷ饔每赡苁峭ü瓒螱PR17的表达而实现的。为了验证这一理论,作者使用siRNA沉默GPR17的表达(图5A)。图5B和5C的结果显示,GPR17的敲除对TNF-α诱导的Col2a1基因和II型胶原蛋白的减少具有?;ぷ饔?。这些发现表明GPR17的表达介导II型胶原的减少。

              在补充材料中,作者检测了普仑司特对GPR17表达的影响。结果表明,普仑司特在基础条件下和TNF-α处理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表达。重要的是,作者发现GPR17的过表达消除了普仑司特对Col2a1基因表达和II型胶原蛋白表达的?;ぷ饔?。这些研究结果表明,普仑司特对TNF-α诱导的II型胶原减少中的有益作用是通过抑制GPR17介导的。

              图5

              6.普仑司特在ATDC5细胞中可恢复TNF-ɑ诱导的SOX-9的减少

              SOX-9是一种在软骨形成中起重要作用的转录因子。SOX-9的表达对抑制TNF-α诱导的II型胶原降解具有重要作用。如图6A中所示,TNF-α诱导SOX-9的mRNA水平降低52%,分别用5μM和10μM普仑司特处理后可增加到73%和95%。与单独TNF-α处理组相比(55%),与上述相同剂量的普仑司特将SOX-9的蛋白质水平分别提高到76%和97%(图6B)。

              图6

              7.普仑司特在ATDC5细胞中可降低TNF-ɑ诱导的MMP-3和MMP-13的表达

              由于MMP-3和MMP-13被认为是参与II型胶原降解的重要的酶,因此作者确定了普仑司特对这两种蛋白表达的影响。图7A显示,TNF-α刺激后,MMP-3和MMP-13的mRNA水平分别增加了3.2倍和3.9倍。然而,5μM的普仑司特将MMP-3和MMP-13 mRNA水平分别降低到2.1倍和2.3倍,10μM的普仑司特将MMP-3和MMP-13 mRNA水平分别降低到1.5倍和1.7倍。与之一致的是,图7B的结果显示,经TNF-α处理后,MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL,高于基线时的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同时,5和10μM普仑司特将MMP-3的蛋白水平分别降低到265.7和185.6pg/mL,MMP-13的蛋白水平分别降低到466.9和327.5pg/mL。

              图7

              8.普仑司特在ATDC5细胞中可抑制TNF-ɑ诱导的IRF-1的表达

              MMP-3和MMP-13受IRF-1的转录调控。在这里,作者测定了普仑司特对TNF-α诱导的IRF-1表达的影响。图8A的结果显示,TNF-α诱导IRF-1在基因水平上的表达增加了3.2倍,而用5μM和10μM普仑司特处理后,IRF-1的表达分别下降到2.1和1.4倍。如预期一致,图8B所示,两剂量的普仑司特分别将IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍,相比之下,单独使用TNF-α处理的IRF-1蛋白水平为2.9倍。后,图8C的免疫染色结果显示,单独TNF-α处理后,IRF-1的表达明显增加到3.2倍。然而,5μM普仑司特可使IRF-1水平降低到2.2倍,10μM普仑司特可使IRF-1水平进一步降低到1.6倍。

              图8

              9.普仑司特抑制TNF-α诱导的JAK2/STAT1通路的激活

              JAK2/STAT1通路已被证明在OA中调节细胞因子和MMPs的产生中发挥关键作用。这项研究中,作者确定了普仑司特阻断GPR17是否会抑制JAK2/STAT1通路的激活。如图9所示,Western Blot分析显示,与基线相比,TNF-α处理显著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平,约为2.7倍和2.9倍。而5μM普仑司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表达,分别为2.1倍和1.9倍。此外,10μM普仑司特进一步将这些值降低到1.5和1.4倍。普仑司特对TNF-α诱导的JAK2/STAT1通路的激活具有较强的抑制作用。

              图9

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              结 论

              综上所述,作者的研究提供了新的证据,表明普仑司特通过阻断GPR17的表达,对TNF-α诱导的II型胶原降解具有?;ぷ饔?。作者的发现提示GPR17可能是治疗OA的一个潜在靶点。然而,还需要更多的试验来进一步研究GPR17及其拮抗剂对骨关节炎进展和发展的影响。

               

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